Jak identifikovat bakterii

Obsah

• stupně
• Metoda 1 Identifikujte bakterii Gramovým barvením
• Metoda 2 Proveďte test barvení Ziehl-Neelsen
• Metoda 3 Studujte chování a vzhled bakterií
• Metoda 4 Interpretovat všechny výsledky

V tomto článku: Identifikace bakterie Gramovým barvením Proveďte Ziehl-Neelsenův test barveníStudy chování a vzhled bakterií Interpretace všech výsledků43 Reference

Identifikace bakterií je složitý úkol. Jedním z důvodů je, že podle odhadů je na světě mezi 10 000 a 1 miliardou bakteriálních druhů! Správná identifikace bakterií je velmi důležitá, zejména v lékařské oblasti, kde správné léčení nemoci do značné míry závisí na typu mikrobu, který způsobuje problém. Ve většině případů se identifikace provádí na základě eliminace. K identifikaci bakterie musíte provést testy barvení, analyzovat její vzhled a sledovat, jak dobře reaguje na různé podmínky. Pokud potřebujete rychlý výsledek, odeberte vzorek DNA do laboratoře.

stupně

Metoda 1 Identifikujte bakterii Gramovým barvením

1. určit pokud jsou bakterie grampozitivní nebo negativní. Gramovo barvení je metoda dělení bakterií mezi dva nejběžnější typy: grampozitivní a grampozitivní. První z nich má silnou buněčnou stěnu sestávající z polymeru zvaného peptidoglykan, který má nejlepší barvení jako tenké stěny gramnegativních bakterií.
   • Některé běžné typy grampozitivních bakterií jsou streptokoky, stafylokoky, mikrokoky (nebo mikrokoky) a listérie.
   • Zde je několik běžných příkladů gramnegativních bakterií: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium a Campylobacter.
2. Přijměte vhodná ochranná opatření. Bakterie a chemické prvky, které použijete během testu, představují riziko pro vaše zdraví. Při provádění testu barvení používejte ochranné brýle, jednorázové nitrilové rukavice a laboratorní plášť. Až budete hotovi, vložte rukavice a všechny ostatní kontaminované materiály do speciálního sáčku. Nezapomeňte dodržovat postupy vaší laboratoře, abyste se zbavili vaku pro kontaminované produkty.
3. Vložte vzorek, který chcete pozorovat, na sklíčko. Chcete-li zahájit test, položte na sterilní sklíčko kapku nebo bakteriální vzorek. Poté posuňte čepel přes Bunsenův hořák třikrát, abyste vzorek opravili a zabránili tomu, aby při oplachování nebo přidávání reagencií vypadl z destičky.
4. Do čepele přidejte 5 kapek fialového krystalu. Na vzorek nalijte pět kapek křišťálově fialového roztoku. Počkejte minutu, než vzorek absorbuje křišťálovou fialovou.
   • Čepel držte na místě špendlíky, abyste si neznečistili ruce.
5. Ostří důkladně omyjte, aby se skvrna odstranila. Použijte kohoutek nebo vytlačovací láhev a nechte vodu vytékat velmi pomalu po dobu až pěti sekund, aby se odstranily zbytky inkoustu, které se na vzorku nepřilepily.
6. Na sklíčko nalijte pět kapek Gram diodové skvrny. Je to roztok skládající se z diody, hydrogenuhličitanu sodného a jodidu draselného, ​​který způsobuje, že se křišťálově fialová tají s buněčnými stěnami bakterií. Nalijte pět kapek roztoku na vzorek a nechte působit jednu minutu.
7. Omyjte vzorek alkoholem nebo kyselinou mléčnou. Alkohol a laceton jsou bělicí činidla a vylučují zabarvení bakteriálních buněčných stěn, pokud jsou gramnegativní. Na vzorek nalijte několik kapek bělidla a nechte působit déle než tři sekundy. Poté zkuste jemně opláchnout vodou po dobu pěti sekund, abyste tyto bělicí prostředky odstranili.
   • Pokud necháte bělidlo pracovat dlouho, může to mít za následek zmizení grampozitivních bakterií, což má za následek falešně negativní.
8. Proveďte kontrastní test se safraninem. Safranin je červené barvivo, které kontrastuje s křišťálovou fialovou barvou, a tak zabarví bakterie neovlivněné fialovým zbarvením. Na vzorek nalijte asi pět kapek safraninu a nechte působit jednu minutu. Poté zkuste jemně opláchnout vodou po dobu pěti sekund.
9. Vizualizujte svůj vzorek při zvětšení 1000x. Bakterie se stanou fialovými nebo fialovými, pokud jsou Gram pozitivní, nebo růžové, pokud jsou Gram negativní kvůli safraninu.

Metoda 2 Proveďte test barvení Ziehl-Neelsen

1. Tuto techniku ​​použijte k detekci bakterií odolných vůči kyselinám. Tyto druhy obsahují větší množství lipidů, což je činí odolnější vůči barvivům používaným při barvení podle Grama. Bakterie odolné vůči kyselinám patří do rodu Mycobacterium, který zahrnuje bakterii zodpovědnou za tuberkulózu (M. tuberculosis). K barvení bakterií odolných vůči kyselinám musíte použít červené barvivo zvané karbolický fuchsin, odolné vůči oplachování kyselými nebo kyselými roztoky kyseliny sírové.
2. Přijměte vhodná ochranná opatření. Chemické a biologické materiály používané během barvení Ziehl-Neelsen mohou být nebezpečné. Kromě toho budete také muset použít zdroje tepla, jako je Bunsenova tryska, elektrický ohřívač nebo lampa na alkohol. Proveďte test podle pokynů níže.
   • Nasaďte si brýle, nitrilové rukavice a laboratorní plášť.
   • Dávejte pozor, abyste nevdechli výpary z barviv a bělidel a nenechte kapky postříkat oči nebo pokožku. Nádoby udržujte otevřené pod kapotou.
   • Při zahřívání kotouče buďte velmi opatrní. Většina použitých chemikálií je hořlavá. Na sklíčkach nebo jiných zařízeních mohou být také stopy hořlavých látek.
3. Připravte čepel. S kruhovými pohyby rovnoměrně rozprostřete malé množství bakteriálního vzorku do středu sterilního sklíčka. Váš vzorek by měl zaujímat asi 10 mm x 20 mm.
4. Vysušte čepel. Umístěte čepel na sušicí strukturu tak, aby vzorek směřoval nahoru. Nechte ji přirozeně schnout po dobu 30 sekund. Nepokoušejte se čepel sušit hadříkem.
5. Zajistěte vzorek teplem. Se vzorkem nahoře posuňte čepel dvakrát nebo třikrát přes zapálený Bunsenův hořák. Můžete také umístit nůž na elektrický ohřívač nastavením teploty mezi 65 ° C a 75 ° C po dobu nejméně dvou hodin. Dejte pozor, abyste vzorek nevařili nebo nespálili.
6. Přidejte karbolický fuchsin k čepeli. Na sklíčko nalijte několik kapek tohoto roztoku. Nalijte dost na to, abyste vzorek úplně zakryli.
7. Zahřejte nůž, aby se barvivo fixovalo. Opatrně zahrejte sklíčko nad Bunsenovým hořákem nebo alkoholovou lampou tak, aby vzorek směřoval nahoru, nebo jej umístěte na elektrický ohřívač. Nož zahřívejte na 60 ° C nebo dokud nezačne uvolňovat páru. Nechte barvivo působit po dobu pěti minut.
   • Pokud používáte elektrický ohřívač, zapněte jej při 60 ° C. Pokud se rozhodnete pro alkoholovou lampu nebo hořák Bunsen, měli byste očekávat, že uvidíte páry.
   • Chcete-li ostří udržovat při požadované teplotě po dobu pěti minut, občas jej zahřejte.
   • Dejte pozor, abyste vzorek nevařili, nespálili ani nevysušili.
8. Opláchněte čepel studenou vodou. Nechte jej vychladnout po dobu pěti minut a jemně opláchněte několik sekund čistou vodou. Použijte vodovodní vodu nebo vytlačovací lahvičku k odstranění skvrn barviv, která se ke vzorku nepřilepila.
9. Nalijte na vzorek kyselý alkohol nebo kyselinu sírovou. K úplnému pokrytí vzorku použijte objem 3% (objem / objem) alkoholu nebo 20% kyseliny sírové. Nechte kyselinu fungovat, dokud barva nezmizí a nedosáhne velmi jasně růžového odstínu. Tento proces obvykle trvá asi deset minut.
10. Propláchněte čepel čistou vodou. Jemně umyjte čepel pod tekoucí vodou nebo pomocí stlačovací láhve. Odstraňte všechny zbytky kyselin a barviv.
11. Přidejte kontrastní látku. Jakmile opláchněte sklíčko, nalijte barvivo malachitově zelené nebo methylenové modři. Tato dvě řešení vytvářejí namodralé nebo nazelenalé pozadí, na kterém se objeví červené barvivo, jakož i další biologické materiály, jako jsou lidské buňky a bakterie odolné vůči kyselinám. Nechte látky pracovat jednu až dvě minuty.
12. Čepel opláchněte a osušte. Důkladně opláchněte vodou k odstranění nadměrného kontrastu. Až budete hotovi, osušte zadní stranu čepele suchým hadříkem a nechte ji přirozeně uschnout na stojanu.
13. Vizualizujte svůj vzorek při zvětšení 1000x. Bakterie odolné vůči kyselinám se změní na červenou nebo tmavě růžovou. Ostatní bakterie, nebakteriální buňky a spodní část čepele se změní na zelenou nebo modrou.

Metoda 3 Studujte chování a vzhled bakterií

1. Analyzujte tvar bakterií. Po provedení testu barvení k určení, zda jsou bakterie gram-pozitivní, gram-negativní nebo kyselinovzdorné, je čas přesněji určit druh. Nejprve analyzujte tvar bakterií na sklíčku. Tři nejběžnější formy jsou koky (kulové), spirály a bacily (tyčovitý tvar).
   • Existuje několik variant těchto forem. Například kulaté bakterie (koky) se mohou objevit ve dvojicích (diplococci), v řetězcích, v hromadách nebo ve skupinách po čtyřech (tetrad).
2. Zjistěte, zda jsou bakterie aerobní nebo anaerobní. Vezměte dva vzorky bakterií a vytvořte dvě oddělené kultury. Měsíc musí být anaerobní (pěstován bez kyslíku), zatímco druhý musí být aerobní (pěstován s kyslíkem). Před pozorováním růstu skladujte anaerobní kulturu při 35 ° C na místě bez kyslíku po dobu nejméně 48 hodin.
   • Pokud bakterie rostou v prostředí bez kyslíku, ale ne při vystavení kyslíku, znamená to, že jsou anaerobní.
   • Ačkoli se vyvíjejí v okysličeném prostředí, ale ne v nepřítomnosti kyslíku, jsou aerobní.
   • Když se vyvíjí v obou prostředích, mluvíme o fakultativních anaerobních bakteriích.
3. Proveďte test pohyblivosti. Bakterie je mobilní, pokud se může pohybovat sama s jedním nebo více bičíky. Stupeň pohyblivosti je velmi důležitý při identifikaci určitých bakteriálních druhů. Existuje několik typů pohyblivosti, ale nejbezpečnějším a nejčitelnějším způsobem je polotuhé médium.
4. Vytvořte kulturu pro test motility. Připravte kulturu bakterií v kultivačním bujónu. Podle pokynů níže připravte vývar podle svého výběru.
5. Inokulujte kulturu do polotuhého agaru pro testy motility. Část kultivační půdy se potáhne sterilní očkovací jehlou. Jehlu opatrně zasadte do polotuhé dagarové zkumavky, jako je TTC lagar, kterou jste si připravili na test. Jehla musí proniknout 2/3 agaru.
   • Až budete hotovi, jehlu opatrně vyjměte a dávejte pozor, abyste nepřekročili limity v oblasti očkování.
   • Zkumavka se inkubuje při 30 ° C po dobu 48 hodin.
6. Přečtěte si výsledek testu. Agar pro test pohyblivosti změní barvu na kontakt s bakteriemi. Pokud jsou mobilní, tento červený nebo narůžovělý nádech se rozšíří po celé látce. Jinak bude zbarvení omezeno na místo injekce.

Metoda 4 Interpretovat všechny výsledky

1. Shromážděte své komentáře. Chcete-li znát druh bakterií, musíte shromáždit informace získané z kultur, testů zbarvení a pozorování forem. Pokud zkoumáte vzorky pacienta, mohou příznaky, které se vyskytují, také pomoci určit typ vhodných bakterií.
   • Například, pokud testy ukazují, že bakterie jsou gramnegativní, anaerobní, nemotilní a pokud u pacienta zaznamenáte příznaky, jako je bolest břicha, nevolnost a zvracení, je pravděpodobné, že pacient trpí infekcí bakteriemi. fragilis.
2. Nahlédněte do databáze. Na světě jsou tisíce druhů bakterií. Je nemožné vědět všechno srdcem. Pravděpodobně budete muset nahlédnout do klinické mikrobiologické knihy nebo online databáze, abyste mohli porovnat výsledky testů s informacemi o bakteriálních druzích.
   • Existují vynikající online zdroje pro identifikaci bakterií, ale většina z těchto databází je k dispozici v angličtině, včetně Patricbrc.org a GlobalRPh. Užitečné informace však stále najdete na webu INRA International Microbial Resource Center.
3. Proveďte genetický test, abyste poznali přesný druh bakterií. V některých případech budete možná muset identifikovat druh bakterie. Nejrychlejší a nejjednodušší metoda je provedení testu DNA. DNA testy jsou také užitečné pro identifikaci bakterií rezistentních na tradiční formy barvení a kultivace. V dnešní době jsou testy DNA na mikroorganismech velmi rychlé a mohou být připraveny za méně než dvě hodiny.
   • Pokud nemáte přístup do laboratoře provádějící genetické sekvenování mikroorganismů, pošlete bakteriální vzorek do specializované agentury.